更新時間：2024-11-21
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研究成果：
腫瘤中存在的腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的M2樣表型促進腫瘤生長和轉移。因此，靶向M2樣TAM是一種潛在的癌癥治療策略。然而，針對M2巨噬細胞的全身治療可能會抑制腫瘤組織中的TAM以及在正常過程中起關鍵作用的其他M2巨噬細胞，導致免疫功能低下狀態的風險增加。光動力療法（PDT）是一種非侵入性的局部癌癥治療方法，通過聯合使用光敏劑和無害光產生活性氧（ROS），誘導膜損傷和細胞凋亡。重要的是，PDT的治療效果僅限于光治療的腫瘤區域。因此，在不影響正常巨噬細胞的情況下，局部PDT是一種很好的癌癥治療選擇。本文作者Kyeongsoon Park將二者進行結合，在International Journal of Biological Macromolecules（IF=8.5，一區）上發表題名為Tumor-associated macrophage-targeted photodynamic cancer therapy using a dextran sulfate-based nano-photosensitizer的研究成果，制備了一種基于葡聚糖硫酸鹽的納米光敏劑（葡聚糖硫酸鹽二氫卟吩e6, DS-Ce6），專門針對M2樣TAM進行增強光動力治療（PDT），從而用于抑制腫瘤的生長和轉移。
01
DS-Ce6的合成與表征
DS-Ce6是由DS（SR-A的特異性配體）與Ce6（光敏劑）化學偶聯合成的，作者通過UV/Vis和FT-IR分析證實了DS-Ce6的合成，并使用粒徑分析測量了DS-Ce6的粒徑大小和分布，最后進行了單線態氧1O2的生成測試，在670 nm連續波激光照射下，使用單線態氧傳感器檢測DS-Ce6產生的單線態氧的量，以評估光動力療法的效果。通過這些合成和表征步驟，作者能夠確保DS-Ce6具有預期的化學結構、粒徑和光敏性，使其能夠有效地被M2型TAMs攝取并在光照下產生細胞毒性的活性氧（ROS），從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。隨后作者驗證了M2巨噬細胞SR-A的表達情況，在巨噬細胞的極化狀態中，M2巨噬細胞通常由IL-4和IL-13誘導，通過表達MRs （CD206）和SRs （SR-A, CD204）來識別。Western blot分析結果表明，IL -4衍生的M2巨噬細胞劑量依賴性地增加SR-A的表達。
02
DS-Ce6對IL -4處理巨噬細胞的細胞毒性和細胞內攝取
作者在本實驗研究了DS-Ce6對IL -4處理的巨噬細胞和共培養的4T1/巨噬細胞的體外細胞毒性。結果表明，在所有測試組中，IL -4處理的巨噬細胞的細胞存活率> 95%。經DS-Ce6或未經激光處理的Ce6共培養細胞毒性可忽略不計，這意味著未經激光處理的DS-Ce6不發揮細胞毒性作用。而后作者在共培養的4T1/巨噬細胞中檢測了IL-4處理的巨噬細胞對游離Ce6和DS-Ce6的細胞內攝取以及DS-Ce6與巨噬細胞的特異性結合。在IL-4處理的巨噬細胞中，DS-Ce6的細胞攝取高于游離Ce6；此外，在IL-4處理的巨噬細胞中，DS-Ce6的內化比正常巨噬細胞強得多。數據表明，IL-4誘導的M2巨噬細胞上調SR-A的表達，且DS-Ce6進入M2巨噬細胞是通過特異性結合SR-A介導的。
03
DS-Ce6對共培養4T1- Luc /巨噬細胞和4T1/巨噬細胞三維球體的體外光毒性作用
作者通過生物發光成像來評估DS-Ce6在激光照射下對共培養4T1-Luc/巨噬細胞的體外光療作用。數據表明，DS-Ce6處理后共培養細胞中4T1細胞的BLI明顯降低，且呈劑量和激光照射時間依賴性。此外，在DS-Ce6處理的4T1/巨噬細胞共培養中，即使激光照射時間較短，4T1細胞的BLIs也明顯低于Ce6處理組。而后作者評估了Caspase-3和下游PARP的水平，因為Caspase-3可被來自內在和外在途徑的刺激激活造成凋亡，Western blot分析進一步證實了DS-Ce6光激活后4T1-Luc/巨噬細胞凋亡且定量數據顯示，與Ce6處理的共培養細胞相比，激光照射下，DS-Ce6處理的共培養細胞中Caspase-3和PARP的表達水平增加。CLSM圖像證實，在共培養細胞中，DS-Ce6比Ce6能特異性靶向且更內化DS-Ce6進入M2樣巨噬細胞。將DS-Ce6內化到M2樣巨噬細胞中，在激光照射下產生細胞毒性1O2，產生的1O2有效誘導M2樣巨噬細胞和腫瘤細胞凋亡，導致共培養組4T1細胞BLI降低。這些結果表明，DS-Ce6也能有效誘導4T1/巨噬細胞共培養的腫瘤細胞凋亡。
PDT藥物通常對細胞單層表現出體外光療作用。然而，單層細胞培養模型在復制和模擬實體腫瘤的缺氧條件、病理生理和多細胞耐藥方面存在局限性。因此，作者使用4T1/巨噬細胞的3D球體進一步評估DS-Ce6的光療潛力。從結果可以看出，未經激光照射的Ce6或DS-Ce6處理后的三維球體保持了三維球體的形態。然而，在激光照射下，DS-Ce6治療組三維球體的形態學變化比Ce6組更顯著，證實了DS-Ce6對三維球體的光療效果要強得多。
04
DS-Ce6的體內生物分布及TAM靶向能力
作者采用全身熒光法檢測Ce6和DS-Ce6在體內的生物分布。結果表明在注射后最初1-2小時，Ce6處理小鼠全身可見較強的熒光強度，此后熒光強度迅速下降。注射后12小時，在游離Ce6處理小鼠中觀察到微弱的熒光信號，這意味著大部分Ce6從體內清除。相比之下，在注射后最初1-3小時，DS-Ce6處理小鼠的熒光信號相對較低，此后熒光信號逐漸減弱，但在24小時內全身仍可見。由于DS-Ce6與Ce6相比血液循環更長，因此在注射后12小時，DS-Ce6在腫瘤組織中的積累量相對高于游離Ce6。通過實驗結果作者證實了M2巨噬細胞在腫瘤組織內的分布，證明了DS-Ce6對M2巨噬細胞的靶向能力。
熒光結果顯示，DS-Ce6處理組的熒光信號強于游離Ce6處理組，表明DS-Ce6對M2巨噬細胞的靶向能力高于游離Ce6，這是由于DS-Ce6與M2樣TAM上過表達的SR-A特異性結合。同時，觀察到大量F4/80(綠色)和CD206(藍色)雙陽性巨噬細胞，F4/80和CD206在4T1腫瘤組織內共定位良好，表明M2巨噬細胞在腫瘤組織中浸潤分布豐富。更重要的是，F4/80和CD206陽性的M2巨噬細胞與DS-Ce6的熒光信號匹配良好，表明DS-Ce6可以特異性靶向腫瘤組織內的M2樣TAM。
05
DS-Ce6對4T1-Luc荷瘤小鼠的體內光療作用
通過測定4T1-Luc實體瘤模型的腫瘤生長速率、BLIs和腫瘤重量，進一步研究DS-Ce6的體內光療作用。在注射游離Ce6和DS-Ce6后4小時和9小時，用670 nm激光(50 mW/cm2)照射兩個PDT組的腫瘤部位30分鐘。DS-Ce6+激光照射組的BLI、腫瘤體積和腫瘤重量顯著降低，而其他組則沒有。此外，DS-Ce6+激光照射小鼠切除的腫瘤的照片顯示，與其他組相比，激光治療后結痂。第6天，DS-Ce6+激光照射組的腫瘤切片通過H&E和TUNEL染色觀察到光療效果一致。通過染色結果可以看出，激光治療后H&E染色可見結痂，DS-Ce6 +激光照射組腫瘤切片檢測到TUNEL凋亡信號。DS-Ce6這些優異的光療效果歸因于其特異性靶向腫瘤組織中M2樣TAM的能力。與游離Ce6相比，DS-Ce6通過特異性SR-A結合在腫瘤周圍的M2巨噬細胞中積累更高。因此，DS-Ce6特異性遞送至腫瘤組織內的M2巨噬細胞，在激光照射下有效產生細胞毒性1O2，產生的1O2誘導M2巨噬細胞和腫瘤細胞凋亡。
文章小結：
綜合實驗結果我們可以看出該研究基于葡聚糖硫酸鹽（DS）的納米光敏劑（DS-Ce6）在光動力癌癥治療中的應用能力較好，在具有靶向性的同時結合光動力療法誘導腫瘤細胞的凋亡，這種局部治療方法可以減少對正常組織的損害，提高治療效果。并且合成的納米材料有良好的生物相容性和生物分布，具有較長的血液循環時間和較高的腫瘤組織積累，這有助于提高治療效果并減少副作用。在體外共培養和三維共培養球體模型中，DS-Ce6顯示出顯著的光毒性效果，能夠有效誘導腫瘤細胞凋亡。在體內模型中，DS-Ce6結合激光照射能夠顯著抑制腫瘤生長，導致腫瘤消退。該研究提供了一種潛在的臨床應用方法，即通過靶向TAMs來增強PDT的效果。這種方法可能對多種依賴TAMs的腫瘤類型有效，為未來的研究提供了基礎，包括優化DS-Ce6的合成方法、探索其在不同類型腫瘤中的適用性、以及評估其與其他治療方法（如免疫療法、化療）的聯合應用潛力。總的來說，該研究展示了DS-Ce6作為一種新型納米光敏劑在光動力癌癥治療中具有顯著的應用潛力，尤其是在靶向M2型TAMs方面。
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