SD大鼠乳鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法

1. 將新生24h的SD大鼠用75%乙醇浸泡5min，開胸，取出心臟后于含有雙抗的預(yù)冷過的D-HANKS中漂洗兩遍，移入超凈臺(tái)。

2. 仔細(xì)剪除大血管，左右心房及右心室和室間隔，保留左心室，去除內(nèi)、外膜，PBS清洗。

3. 用眼科剪將心室肌剪碎至約1mm3，滴加1ml胎牛血清，均勻接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，組織塊間隔1-2mm，放入5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4. 4小時(shí)后去除培養(yǎng)皿，加入3ml含有20%FBS和1%雙抗的H-DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 一般情況下48小時(shí)后可見有細(xì)胞爬出，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 5-7天后有大量細(xì)胞鋪滿皿底，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍，加入2ml胰酶進(jìn)行消化1分鐘左右。

7. 吸去胰酶。加入*培養(yǎng)基終止反應(yīng)，并用移液器反復(fù)吹打。

8. 傾斜培養(yǎng)皿稍等片刻，讓組織塊沉淀后吸去上層細(xì)胞懸液，70μm細(xì)胞篩過濾后接種至12孔板為后續(xù)共培養(yǎng)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。