腸道腫瘤類器官的研究與應用

類器官是一項創新性較高的研究技術，近幾年來受到科研人士的追捧和廣泛好評。目前，我們國家在政策層面也給予了大力地支持。2021年科技部發布的“十四五”國家重點研發計劃“干細胞研究與器官修復”重點專項中也特別提到疾病類器官模型。

什么是類器官（Organoids）？

類器官屬于三維（3D）細胞培養物，包含其代表器官的一些關鍵特性。類體外培養系統包括一個自我更新干細胞群，可分化為多個器官特異性的細胞類型，與對應的器官擁有類似的空間組織并能夠重現對應器官的部分功能，從而提供一個高度生理相關系統。成體干細胞的組織樣本、單一成體干細胞或者通過多能干細胞的定向誘導分化都能夠產生類器官。而細胞系異質性差，遺傳信息丟失，無法模擬組織器官體內的三維結構‍；動物模‍型具有建模周期長，成本高等問題。

類器官的應用前景

‍‍‍‍‍2013年，類器官技術被Science譽‍為10 大科技進展，2017年，又被Nature Methods評為生命科學領域的年度技術。類器官技術具有*的創新性，近年來一直是研究熱點，到目前為止已取得多項重大研究領域的突破‍，但其應用研究目前依然處于起步階段，其作為一種工具，在廣泛的應用研究方面潛力巨大，包括發育生‍物學、疾病病理學、細胞生物學、再生機制、精準醫療以及藥物毒性和藥效試驗。對于這些應用以及其他應用，類器官培養‍實現了對現有2D培養方法和動物模型系統的高信息量的互補。此外，通過類器官繁殖的干細胞群取代受損或者患病的組織，類器官提供自體和同種異體細胞療法的可行性，未來這一技術在再生醫學領域也擁有巨大的潛力。‍‍‍‍‍‍

2022 年 1 月 19 日，由諾丁漢大學醫學院癌癥遺傳學和干細胞組Abdolrahman S. Nateri教授團隊在ONCOGENESIS(影響因子7.485)發表了新研究成果，題為《Anti-miR-135/SPOCK1 axis antagonizes the inflfluence ofmetabolism on drug response in intestinal/ colon tumourorganoids》。

圖：研究概要和亮點

本研究旨在通過雙突變Apc Min Fbxw7 ΔG小鼠結直腸癌 (CRC) 模型的十二指腸息肉和非息肉衍生類器官 (mPO 和 mNPO) 來研究失調miRNA與代謝成分之間的關系。文中分析了mPO 和 mNPO中表達失調的miRNA和代謝相關基因，發現miR-135可能靶向Spock1基因。SPOCK1的上調表達水平與CRC的疾病進展密切相關。敲低CRC患者來源的腫瘤類器官(CRC tPDO)中miR-135b的表達水平，可以降低SPOCK1 表達水平、葡萄糖消耗和乳酸分泌。然而，由miR-135b過表達誘導的SPOCK1增加，則促進Warburg效應，從而促進5FU的抗腫瘤作用。因此，與miR-135b反義核苷酸的組合療法可能代表了一種新的CRC治療策略。

研究背景

腸道類器官是一種實驗模型，它結合了在體外產生整個隱窩上皮細胞多樣性，以及生成的生物量相對較快和易于處理的優勢。因此，腸道類器官是探索內在上皮細胞缺陷復雜性的良好的實驗平臺。至今，只有少數的研究涉及到腸道類器官培養物中代謝物的鑒定。

研究結果

1. 與mNPO相比，mPO中葡萄糖消耗和乳酸產量增加

腺癌是常見的小腸癌類型，大多數這些腫瘤發生在十二指腸，這是小腸最靠近胃的部分。為了分析小息肉和非息肉部位中的葡萄糖和乳酸代謝譜，研究者構建小鼠十二指腸息肉衍生類器官(mPO)與非息肉衍生類器官(mNPO)模型，通過對其培養基分析發現，與mNPO相比，mPO的葡萄糖消耗率和乳酸生成更高，這表明代謝向無氧糖酵解的轉變以維持更高的mPO生長和新的腫瘤細胞的產生。

為了驗證上述代謝測定中的結論，研究者采用qPCR分析了12個代謝相關基因的mRNA表達水平，所選基因均參與細胞代謝過程(葡萄糖、活性氧、脂肪酸攝取和組織重塑)。結果表明Aldob、Cyba、HexII、Fabp6、Slc2a5和Spock 1(又名Testican-1，是一種細胞外基質蛋白)、Spock2的表達水平上調，而G6pc、Slc2a1和Slc2a2下調，但是Ephx2和Gstt1在mPO與mNPO中沒有變化。蛋白質印跡分析也證實了SPOCK1和SPOCK2蛋白在mPO中被誘導，這與 mRNA水平的表達相一致。其中，SPOCK1 是 TGF-β的正向下游調節因子，其表達通過 Wnt/β-catenin 途徑進行調節。除了生理功能外，SPOCK1還是CRC的關鍵調節因子。

2. 分析mPO與mNPO中癌癥相關miRNA的表達差異

為了鑒定息肉腫瘤發展過程的miRNA，采用miRCURY LNA miRNA測定十二指腸 mNPO和mPO之間的miRNA表達譜，使用Exiqon-GenEx-qPCR分析軟件對miRNA表達(2^–ΔΔCT) 進行標準化和統計分析。最終，鑒定了幾個與癌癥相關miRNA，與mNPO相比，在mPO中的表達存在顯著差異。其中包括 let-7 家族成員在內的幾種 miRNA顯著下調，以及13個miRNA在mPO中顯著上調表達(>3倍)。

3. miR-135靶向代謝介質細胞外基質糖蛋白SPOCK1

通過TargetScan Web預測發現Spock 1是miR-135的潛在靶標。而且，SPOCK1的表達增加與人結腸腺癌(COAD)的總生存期(OS)差有關。階段圖分析表明，在COAD癌癥階段，SPOCK1的表達逐漸升高，在晚期階段(StageIII 和StageIV)的表達相對最高。

對預測的miR-135-5p的系統搜索分析顯示，超過670個預測基因與細胞代謝(葡萄糖、活性氧、代謝、代謝、脂肪酸攝取和組織微環境)相關。先前的研究也表明，抑制CRC小鼠模型中的miR-135b，可通過控制增殖、侵襲和凋亡相關基因，進而降低腫瘤生長，其可作為檢測CRC和晚期腺瘤的無創生物標志物。臨床患者衍生的類器官 (PDOs)這代表了一個臨床相關的研究平臺。接下來，研究團隊培養了患者來源的腫瘤類器官(tPDO)和鄰近的癌旁來源的類器官(hPDO) 。qRT-PCR 分析發現CRC tPDO 中SPOCK1和miR-135b的表達水平顯著高于CRC hPDO。

為了研究miR-135b對SPOCK1表達水平的調節作用，用對照載體慢病毒(Control)或 miRZip-135b(anti-miR-135b)慢病毒轉導tPDO，而后驗證了抗miR-135b顯著降低了CRC tPDO中miR-135b的表達水平。為了確認miR-135b/ SPOCK1軸能夠影響tPDO中的代謝反應，對重要的腫瘤代謝物濃度(抗miR-135b處理的類器官培養基中的乳酸和葡萄糖)進行了測定，發現抗miR-135b可減少葡萄糖消耗和乳酸產生。此外，為了確認miR-135b/ SPOCK1轉錄調控軸，又開展了雙熒光素酶報告分析，發現與抗miR-135b共轉染顯著抑制了含有野生型SPOCK1 3'-UTR-reporter的細胞中熒光素酶活性，而非突變型SPOCK1 3'-UTR-reporter。此外，抑制CRC tPDO中的miR-135b表達后，qRT-PCR檢測發現SPOCK1 mRNA水平顯著降低，而SPOCK2沒有變化。總之，以上結果證明了SPOCK1是miR-135b的靶標基因，用抗miR-135b治療能夠降低SPOCK1的表達。

4. 抑制miRNA-135/ SPOCK1軸使tPDOs細胞對5-FU誘導的細胞抑制作用和細胞毒性敏感

研究團隊在tPDO中敲低miR-135b后進行了5-FU(5-Fluorouracil)的細胞抑制和形態學測定，發現與miRZip-135b的聯合治療可使tPDOs細胞對5-FU誘導的細胞抑制作用敏感，并加劇了對SPOCK1 基因表達的抑制作用。

此外，通過 SRB 比色法評估了同步/血清饑餓的人APC突變的結腸直腸癌細胞系DLD-1 與正常結腸細胞CCD-841在用10次增加劑量的5-FU±anti-miR-135治療后的存活率。結果表明，與CCD-841-anti-miR-135細胞(IC50=17.48±1.083)相比，5-FU在DLD-1-anti-miR-135(IC50=10.86±1.135)中表現出更大的細胞毒性。miR-135b敲低(+anti-miR-135) 對結腸癌DLD-1細胞的敏感性高于非癌性(CCD-841) 細胞[DLD-1+anti-miR-135(IC50=5.383±1.188) vs. CCD-841+抗miR-135細胞(IC50= 14.07±1.103)]。選擇性指數(SI)的計算方法是將抗miR-135細胞的IC50除以 miR-135b敲低細胞的IC50(DLD-1 SI=2.017 vs. CCD-841 SI=1.242)。SI是一個給出選擇性概念的指標，最高值表示更具選擇性的候選者。我們的數據與miR-135抑制可影響CRC細胞系對化療藥物耐藥性的觀察結果一致。

本文小結

本研究創新性地采用腸道類器官模型，研究腫瘤和鄰近的非腫瘤類器官(tPOh和tNPO)中具有不同的代謝活性，以及與代謝相關的miRNA表達譜，并確立了miR-135通過靶向SPOCK1從而影響細胞代謝的關鍵作用，證明了miR-135和SPOCK1協同影響腫瘤細胞的代謝和藥物反應。這為CRC的治療提供了新的思路和理論依據，也為類器官模型在腫瘤藥物篩選的研究和應用方面打下了一定程度的基礎。

文獻來源：Babaei-Jadidi, R., Kashfi, H., Alelwani, W. et al. Anti-miR-135/SPOCK1 axis antagonizes the influence of metabolism on drug response in intestinal/colon tumour organoids. Oncogenesis 11, 4 (2022). 

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